Разработка эффективных систем экспрессии бактериолитических ферментов бактерий,  ценных для медицины

Бактериолитические ферменты разрушают клетки патогенных бактерий, включая антибиотико-резистентные штаммы. Использование в практике бактериолитических ферментов, продуцируемых бактериями, осложнено проблемами их получения в достаточных количествах. Для решения этой проблемы разработаны эффективные гомологичные системы экспрессии для двух бактериолитических протеаз Л1 и Л5 Lysobacter capsici XL1. Успешно масштабированы процессы культивирования экспрессионных штаммов. Оптимизированы схемы выделения белков в гомогенном виде (Рисунок 1). В результате, решена проблема получения в достаточных количествах ценных для медицины бактериолитических ферментов, которые являются перспективными для разработки на их основе инновационных лекарственных препаратов с антимикробным и протеолитическим действием. Данная разработка обеспечивает технологический суверенитет России в области изучения и использования в практике бактериолитических ферментов бактерий и соответствует приоритетному направлению научно-технологического развития – Превентивная и персонализированная медицина, обеспечение здорового долголетия. Уровень готовности технологии – 5 (лаборатория биохимии клеточной поверхности микроорганизмов, рук. к.б.н. Леонтьевская Н.В.)

Установлено, что нокаут-мутации в генах, кодирующих переносчики фосфата, приводят к изменению устойчивости клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae к тяжелым металлам. Нокаут гена PHO87, кодирующего низкоаффинный транспортер фосфата цитоплазматической мембраны, повышает устойчивость к ионам марганца, серебра и ванадата, а нокаут его паралога PHO90 повышает чувствительность к ионам марганца. Клетки штамма-нокаута гена PHO87 накапливают в 10 раз меньше марганца, а клетки штамма-нокаута гена PHO90 накапливают вдвое больше марганца, чем клетки дикого типа Переносчики фосфата участвуют в регуляции поглощения тяжёлых металлов, и соответствующие нокауты могут быть полезны для биоремедиации и биоанализа этих загрязнителей (Лаб. регуляции биохимических процессов, рук. д.б.н. Кулаковская Т.В.)

Разработана методика по созданию биоанодов микробного топливного элемента (МТЭ) путем «one-pot» восстановления оксида графена в процессе роста биопленки уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans на войлочных графитовых электродах. Данный простой, эффективный и экологически чистый метод синтеза оксида графена позволяет добиться увеличения мощности МТЭ в 1,5 раза по сравнению с контрольным биоанодом и избавиться от предварительных стадий получения наноматериалов. Результаты могут быть использованы при создании высокоэффективных биотопливных элементов для одновременной генерации электроэнергии и очистки окружающей среды от органических отходов (Лаб. биосенсоров, рук. д.х.н. А.Н. Решетилов)

Разработан и валидирован стандартизированный протокол длительного хранения изученных групп цианобактерий и микроводорослей (Charophyta, Chlorophyta, Heterokontophyta из коллекции ВКМ, значительно различающихся по ключевым фенотипическим признакам), включающий использование жидкой питательной среды с диметилсульфоксидом и два метода контроля жизнеспособности (рост в жидкой среде и штрихи на агар). Двухэтапный протокол с использованием криопротекторов обеспечивает 100% эффективность консервации для всех изученных штаммов независимо от их таксономического положения, гарантирует сохранение жизнеспособности культур, минимизирует временные и материальные затраты, а также снижает риск контаминации (Всероссийская коллекция микроорганизмов, рук. д.б.н. М.С. Куликовский)

Установлен механизм адаптации к пониженным температурам микромицета Leuconeurospora pulcherrima, связанный  с регуляцией текучести мембран за счёт значительного увеличения относительного содержания линоленовой кислоты в фосфолипидах, снижением соотношения стерины/фосфолипиды, преобладанием в мембранах небислойных липидов и увеличением соотношения маннит/трегалоза (Всероссийская коллекция микроорганизмов,  рук. д.б.н. М.С. Куликовский)

Выделен ряд новых штаммов из различных экосистем, проведено исследование метаболического потенциала аэробных метано- и метилотрофных бактерий, использующих метан и/или метанол в качестве единственного источника углерода и энергии, протестированы новые подходы для переформатирования метаболизма биотехнологически перспективных штаммов с целью выяснения путей их использования как продуцентов разнообразных ценных метаболитов (Лаб. радиоактивных изотопов, рук. к.б.н. И.И. Мустахимов)

Обнаружена высокая метаболическая гибкость генетически модифицированного штамма M. alcaliphilum 20Z с разомкнутым циклом трикарбоновых кислот, обусловленная разветвленностью этого цикла и обратимостью ферментов метаболизма гликогена, что является предпосылкой для дальнейшей успешной генетической модификации метанотрофа с целью получения ценных продуктов из метана (Лаб. радиоактивных изотопов, рук. к.б.н. И.И. Мустахимов) 

Разработан эффективный способ микробиологического синтеза 20β-восстановленных прогестинов, влияющих на поведенческие реакции, связанные со стрессом и тревогой, и активирующих Pgr-зависимые транскрипционные пути в тканях головного мозга и яичников у рыб Danio rerio. Экспериментально подтверждена функциональность синтезированного прогестина в качестве функционального регулятора в физиологии костистых рыб. Результаты важны для использования в аквакультуре (Лаб. микробиологической трансформации органических соединений, рук д.б.н. Донова М.В.)

Разработана Комплексная база данных бактериальных генов, ответственных за деструкцию полициклических ароматических углеводородов (PAHgeneDB).  База данных предназначена и используется для функциональной характеристики микробных сообществ почв (в том числе сообществ антропогенно нарушенных почв) для определения потенциала сообществ к самовосстановлению и для планирования биотехнологических подходов и мероприятий по ремедиации почв (Лаб. физиологии микроорганизмов, рук. д.б.н. Вайнштейн М.Б.)

Всероссийская коллекция микроорганизмов (рук. д.б.н. Л.И. Евтушенко)

Опубликованы описания 5 новых родов (Crystallibacter, Gordonibacillus, Geochorda, Carboxydochorda, Aliichlorella) и 23 новых вида бактерий, архей, дрожжевых грибов и микроводорослей. Предложения новых таксонов основываются на результатах сравнительного анализа геномов и таксономически-значимых генов/локусов ДНК, а также отличиях изученных организмов от представителей ближайших родов и видов по фенотипическим признакам, в том числе составу и структурам гликополимеров клеточных стенок. Организмы новых таксонов выделены из почв различных природных и антропогенных экосистем, из образцов древнего вулканического пепла и глубинной подземной биосферы Сибири, а также из микробиомов растений, лишайников и животных.

Лаборатория биологии плазмид (рук. чл.-корр РАН А.М. Боронин)

Изучен таксономический состав бактериальных сообществ городской пыли в образцах трех биотопов (аэрозоль воздуха, поверхность листьев древесных растений и поверхность асфальта), отобранных в транспортной, жилой и рекреационной зонах Москвы. С использованием программных обеспечений FAPROTAX и PICRUSt2 спрогнозированы следующие функциональные характеристики: 1) во всех исследуемых образцах наиболее распространены бактерии, получающие энергию за счет окисления органических соединений; 2) на способность к деградации ксенобиотиков бактериальными сообществах пыли филлопланы влияет антропогенная нагрузка; 3) устойчивость членов бактериальных сообществ к ванкомицину, бета-лактамам (в том числе к карбапенемам), аминогликозидам и тетрациклинам. Сконструированной экологической сетью установлено, что модулеобразующими хабами в бактериальных сообществах Москвы являются представители условно-патогенной микрофлоры.

Рисунок. Численность культивируемых антибиотикоустойчивых бактерий от общей численности гетеротрофов (данные приведены в процентах). Обозначения: G –  рекреационная зона, R – жилая зона, T – транспортная зона, F – пробы из воздуха, L – пробы с листьев, P – пробы с асфальта.

Лаборатория регуляции биохимических процессов (рук. д.б.н. Кулаковская Т.В.)

Получены новые данные о вовлечении белков, обеспечивающих гомеостаз фосфата у дрожжей, в адаптацию к различным субстратам и стрессам. Показано, что переносчики фосфата цитоплазматической мембраны дрожжей S. cerevisiae Pho87, Pho89, Pho90 и Pho91 вовлечены в адаптацию к росту при высокой концентрации этанола. Получены новые свидетельства в пользу того, что полифосфаты митохондрий являются энергетическим резервом этих органелл, необходимым для формирования полноценных митохондрий при переходе от гликолиза к окислительному фосфорилированию.

Лаборатория энзиматической деградации органических соединений

(рук. к.б.н М.П. Коломыцева)

• Впервые получена рекомбинантная форма промышленно ценной лакказы из аскомицета P. roridum VKM F-3565, относящейся к редко встречающимся в природе алкалофильным грибным лакказам, путем гетерологической экспрессии в клетках дрожжей K. phaffii GS115 с выходом около 20 мг/л. Особенностью рекомбинантной лакказы является её максимальная каталитическая активность в нейтральной среде, что отличает её от большинства ацидофильных грибных лакказ. Полученный рекомбинантный фермент продемонстрировал повышенную устойчивость в нейтральной среде к воздействию хлоридов одновалентных металлов, органических растворителей, большинства детергентов и металлсвязывающего хелатора по сравнению с условиями кислой среды. Рекомбинантная лакказа была способна катализировать олигомеризацию фенилпропаноидов (аналогов лигнанов) в нейтральной среде, что приводило к образованию тримерных продуктов с потенциалом применения в фармакологической и пищевой промышленностях.

Лаборатория микробной энзимологии (рук. д.б.н. А.А. Леонтьевский)

• Установлено существенное разнообразие в организации важнейшего фосфонатазного пути катаболизма природных органофосфонатов, вносящего существенный вклад в глобальный круговорот фосфора. У деструктора ароматических и фосфорорганических ксенобиотиков Pseudomonas putida CH2 впервые выявлено наличие в геноме двух полных генов фосфонатазы, один из которых, по данным филогенетического анализа, получен путем горизонтального переноса, предположительно, от P. aeruginosa. У P. protegens 23_4, в геномном контексте фосфонатазного оперона обнаружен ген hpnW. Показано, что кодируемая им новая флавиновая оксидаза дублирует по своей функции входящую в фосфонатазный ферментный путь трансаминазу PhnW, но экспрессия указанных ферментов находится под контролем двух различных регуляторов транскрипции. Таким образом, существующий в литературе консенсус о высокой степени изученности и схожести организации фосфонатазных ферментных путей у бактерий различных таксонов требует пересмотра.

Лаборатория биохимии клеточной поверхности микроорганизмов

(рук. к.б.н. Н.В Леонтьевская)

• Расширена антимикробная характеристика бактериолитической амидазы Ami Lysobacter capsici XL1. Впервые установлена способность Ami лизировать живые клетки различных штаммов Bacillus anthracis, в т.ч. антибиотико-устойчивые, а также содержащие плазмиды вирулентности и иммуногенности pXO1 и рХО2, и штаммов Bacillus cereus с гемолитической, лецитиназной и фосфатазной активностями. Таким образом, актуальна разработка ферментного антимикробного препарата на основе бактериолитического фермента Ami.

Лаборатория биологии вирусов бактерий (рук. к.б.н. А.М. Шадрин)

• Изучены свойства эндолизина бактериофага vB_EfS_SE – PlySE и двух химерных эндолизинов, на основе его углевод-связывающего домена (CBD): PlyIME-SE и PlySheep-SE. Эндолизин PlySE имеет необычную структуру – состоит не из одной субъединицы, как у большинства изученных бактериофагов, а из 4-х. Одна из субъединиц состоит из каталитического домена и CBD, и трёх коротких, содержащих только домен CBD. Короткие субъединицы синтезируются путём альтернативной инициации трансляции с RBS расположенного внутри кодирующей последовательности мРНК. Конструкции для экспрессии химерных эндолизинов содержали каталитические домены генов эндолизинов plyIME и plySheep, которые были получены методом синтеза de novo. В результате было выявлено, что эндолизин PlySheep-SE, последовательность энзиматического домена которого была взята из данных метагенома овцы, обладал более широким диапазоном активности рН по сравнению с эндолизинами PlySE и PlyIME-SE. При замене каталитических доменов специфичность химерных эндолизинов не изменялась, что указывает на то, что за специфичность действия эндолизина отвечает его тетрамерный углевод-связывающий домен.

Лаборатория физиологии микроорганизмов (рук. д.б.н. М.Б. Вайнштейн)

• Разработана новая (усовершенствованная) версия пакета компьютерных программ «Генератор метаболических путей GenMetPath 2.0», предназначенная для выявления возможных вариантов метаболических путей, способных конвертировать заданный субстрат в заданный продукт, включая образуемую биомассу растущих клеток. Пакет программ включает в себя оригинальные математические и программные решения, позволяющие в том числе выявить участки искомого метаболического пути, а также биохимические реакции, лимитирующие возможности данного пути биоконверсии. Программный пакет является эффективным инструментом исследования материально-энергетического баланса клеточного метаболизма и может быть использован для планирования генетической модификации клеток при создании продуцентов заданных продуктов.

Лаборатория биосенсоров (рук. д.х.н. А.Н. Решетилов)

• Продолжены работы по улучшению аналитических характеристик ферментных и микробных электрохимических биосенсоров и биотопливных элементов с использованием наноматериалов. Показано, что применение в рецепторном элементе аналитических устройств на основе матричных графитовых электродов, модификации графеновыми чернилами, приводит к значительному повышению амплитуды сигналов ферментных биосенсоров. Исследования проведены для глюкозооксидаз из разных источников. Использование проводящего композита на основе терморасширенного графита и бактериальной целлюлозы для иммобилизации мембранных фракций бактериальных клеток Gluconobacter oxydans позволяет получить двукратное снижение уровня минимально определяемой концентрации глюкозы и более чем в два раза увеличивает воспроизводимость сигналов.

В рамках работ по использованию биосенсорного метода для оценки особенностей метаболизма микроорганизмов показано присутствие конститутивной системы транспорта и начального метаболизма метанола в клетках Rhodococcus wratislaviensis ВКМ Ac-2631. Метод позволяет оперативно и с минимальными материальными затратами провести также оценку некоторых физиологических особенностей дрожжей-метилотрофов, совпадающих с данными, полученными классическим методом.

Лаборатория микробиологической трансформации органических соединений (рук. д.б.н. М.В. Донова)

На основе гетерологической экспрессии гена 3-кетостероид-1-дегидрогеназы из Nocardioides simplex в E.coli создан клеточный биокатализатор, осуществляющий 1-дегидрирование 3-оксо-4-ен-стероидов пи высоких субстратных нагрузках. По эффективности и селективности биокатализатор превосходит известные мировые аналоги и может быть использован при синтезе преднистероидов, востребованных в медицине и ветеринарии.

1.6.3. – Биологическое разнообразие и биоресурсы

Всероссийская коллекция микроорганизмов (руководитель д.б.н. Л.И. Евтушенко)

Развитие фонда ВКМ

• Каталожный фонд ВКМ пополнен 242 штаммами микроорганизмов, принадлежащих к 69 родам и более 120 идентифицированным видам, отсутствующим или слабо представленным в ВКМ и других коллекциях страны. В числе включенных в фонд культур 144 штамма бактерий (в т.ч., 60 штаммов актиномицетов) и 98 штаммов мицелиальных и дрожжевых грибов.

• Проведена плановая проверка жизнеспособности у более 3000 штаммов фонда ВКМ, сохраняемых различными методами (лиофилизация, криоконсервация в жидком азоте; хранение в стерильной почве и под вазелиновым маслом). Законсервированы и заложены (перезаложены) на хранение штаммы со сниженными показателями жизнеспособности.

• Выполнены работы по таксономической ревизии и ре-идентификации культур фонда ВКМ в соответствии с современной системой. С использованием методов МАЛДИ масс-спектрометрии, секвенирования фрагментов ДНК и полных геномов идентифицировано (ре-идентифицировано) боле 800 штаммов микроорганизмов различных групп. Подтверждены видовая и родовая аффилиации для большинства культур, обнаружено более сотни потенциально новых видов и несколько новых родов. Подтверждена правомочность выделения советскими (российскими) учеными большого числа новых видов в домолекулярный период микробиологии.

Научные исследования

• Охарактеризованы и описаны новый род дрожжей Rasporella, ассоциированных с насекомыми, и новый род бактерий Alkalisalibacterium, обнаруженных в донных отложениях содово-соленого озера (Республика Бурятия). Описаны новые анаэробные виды Methanobacterium shpitsbirgense (археи) и Pelosinus baikalensis (бактерии), найденные в многолетнемерзлых отложениях острова Западный Шпицберген и холодных пресноводных озерах. Из арктических криопэгов выделены и частично охарактеризованы анаэробные психроактивные бактерии других родов - Acetobaсterium, Labilibaculum и Trichococcus.

• Описано семь новых видов актиномицетов рода Kribbella, происходящих из почв различных регионов России; предложено дополненное и исправленное описание рода. Впервые у представителей рода обнаружены спорангиеподобные структуры. Установлено, что клеточные стенки криббелл содержат специфичные для видов комбинации уникальных гликополимеров (разные по структуре тейхуроновые и/или тейхулозоновые кислоты); у всех видов присутствует разветвлённый маннан – хемотаксономический маркер рода.

• Результаты изучения гликополимеров клеточной стенки актиномицетов в таксономическом аспекте выявили специфичные для рода и видов Rathayibacter (Microbacteriaceae) наборы гликополимеров. Штаммы каждого вида содержат разветвленные рамноманнаны или/и рамнаны (различающиеся по структуре и включающие рамнозу в D-конфигурации); большинство видов имеют дополнительно тейхуроновые кислоты. В отличие от Rathayibacter, для Curtobacterium характерен неразветвленный L-рамнан в сочетании с кислыми полисахаридами, а для Clavibacter – пируватсодержащий галактоманнан и разные галактофурананы.

• Исследованы физиологические свойства клинически значимых дрожжевых грибов Candida albicans, C. parapsilosis и C. tropicalis - наиболее распространенных оппортунистических видов, ассоциированных с инвазивной кандидозной инфекцией, часто обнаруживаемых в плодоовощной продукции. Результаты исследования дрожжей вышеупомянутых видов, выделенных из плодов овощных и фруктовых растений, показали, что среди них присутствуют штаммы, устойчивые к антимикотикам группы азолов. Больше всего устойчивых штаммов было выявлено среди изолятов вида C. tropicalis, они оказались также наиболее активными продуцентами протеаз и фосфолипаз.

• Проанализировано современное состояние проблемы биоразложения нитроцеллюлозы, как опасного промышленного отхода, в том числе с использованием сульфатвосстанавливающих бактерий и микромицетов. Наиболее перспективными микроорганизмами с точки зрения эффективности процесса деградации нитроцеллюлозы являются бактерии рода Desulfovibrio, грибы Fusarium solani и Sclerotium rolfsii и их консорциумы. Приводятся сведения о ферментах, участвующих в процессе деградации, возможных механизмах реакций, а также о влиянии на процесс добавления в реакционную смесь доноров и акцепторов электронов.

Лаборатория радиоактивных изотопов (руководитель к.б.н. И.И. Мустахимов

• Экспериментально установлена метаболическая гибкость метанотрофов класса Gammaproteobacteria, расширяющая  биотехнологический потенциал как продуцентов полиуглеродных соединений из метана благодаря способности штамма к быстрому и продуктивному росту на природном газе. У Methylomonas rapida MP1T обнаружены гены синтеза каротиноидов, свидетельствующие о перспективности метанотрофа в качестве продуцента обогащенного каротиноидами кормового белк,. Получен тройной мутантный штамм Methylotuvimicrobium alcaliphilum 20Z-3E (ΔfumIΔfumCΔmae) по генам, кодирующим яблочный фермент и два ортолога фумаразы, способный при росте на метане накапливать 2,6 ммоль фумарата ∙ г^-1 сухих клеток.)

Лаборатория биологии плазмид (руководитель чл.-корр. А.М. Боронин)

Выделены и охарактеризованы новые ризосферные бактерии, устойчивые к тяжелым металлам (цинку, кадмию, свинцу) и способные к супрессии фитопатогенных грибов и бактерий. В геноме штамма-нефтедеструктора R. qingshengii F2-2 на плазмиде pLP156 обнаружены кластер генов биосинтеза феназинов (антибиотиков), гены биосинтеза растительных гормонов: ауксинов и гиббереллинов, способствующих фитостимуляции. Показано, что этот штамм колонизирует листья и корни рапса и горчицы, стимулирует рост растений, обладает антагонистической активностью в отношении фитопатогенных микромицетов: Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum и Gaeumannomyces graminis var tritici. Обнаруженные фитостимулирующие свойства штамма F2-2 свидетельствуют о его перспективности для использования в биотехнологиях защиты сельскохозяйственных растений и повышения их урожайности

•  1.6.8. Биохимия, биофизика и структурная биология

Лаборатория регуляции биохимических процессов (руководитель д.б.н. Кулаковская Т.В.)

ВНТК  трехмерных структур микроорганизмов (руководитель к.б.н.. Дмитриев В.В.)

• Процесс взаимодействия  клеток дрожжей рода Candida с малорастворимыми гидрофобными субстратами, является эффективной экспериментальной моделью для понимания механизмов формирования биопленок и инвазии в клетки хозяина при патогенезе.  Впервые установлено, что у типовых штаммов C. albicans, С. tropicalis и C. maltosa при росте на гексадекане образуются специфические включения неорганических полифосфатов в клеточной стенке, а также экзовезикулы, содержащие эти биополимеры. Обработка специфической полифосфатазой Ррх1 приводит к исчезновению полифосфатов в везикулах и клеточной стенке, что фиксируется как с помощью флуоресцентной так и электронно-сканирующей микроскопии, а также  к высвобождению фосфата в инкубационную среду. Предположено, что полифосфаты как полианионы являются матрицей для иммобилизации окислительных ферментов как в клеточной стенке, так и в составе везикул.

Микрофотография клеток C. tropicalis,  выращенных на среде с гексадеканом, шкала – 5 мкм. Окраска ДАПИ при высокой концентрации (50 мкМ) приводит к оранжевой флуоресценции структур, содержащих неорганические полифосфаты (верхний рисунок, видны включения в клеточной стенке и агломераты  внеклеточных везикул),  при обработке препаратов биомассы полифосфатазой Ррх1 внеклеточные полифосфаты подвергаются гидролизу и оранжевая флуоресценция исчезает.